PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Tytuł oryginalny: Enzymatyczna metoda otrzymywania D-glukozy ze skrobi
Politechnika Śląska (www)
Wydział Chemiczny (www)
Katedra Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii (www)
Kierownik Katedry: dr hab. inż. Mirosław Gibas prof. Politechniki Śląskiej
Adres:
ul. B. Krzywoustego 4
44-100 Gliwice
Zadanie 1. Oznaczanie aktywności amylazy.
Sprzęt:
– statyw z probówkami,
– pipety,
– lejki,
– sączki karbowane,
– spektrofotometr,
– łaźnia wodna,
– waga analityczna.
Materiał i odczynniki:
– preparat enzymatyczny
– substrat skrobiowy. 0.5g skrobi rozpuszczalnej, 1 g NaCl i 2 g cytrynianu sodu rozpuścić w 100 ml wody ogrzewając do wrzenia. Dodać 1g benzoesanu sodu dla konserwacji,
– 0.9% roztwór NaCl,
– 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego,
– roztwór jodu. 2g KI rozpuścić w 5 ml wody i w tym roztworze rozpuścić 1g jodu, po czym uzupełnić wodą do 300ml. Rozcieńczyć r-r macierzysty 150 razy,
– 1% roztwór skrobi. 1g skrobi rozpuścić w 80 ml wrzącej wody. Po rozpuszczeniu ostudzić i uzupełnić wodą do 100 ml.
– Roztwory wzorcowe zawierające 2,4,6 i 8 mg skrobi w 1 ml. Rozcieńczyć 1% roztwór skrobi (10 mg/ml) biorąc 2,4,6 i 8 ml i uzupełniając wodą do 10 ml.
Wykonanie ćwiczenia:
Zasada oznaczenia:
Oznacza się ilość rozłożonego substratu (skrobi) na podstawie stopnia zmniejszenia się zabarwienia z jodem. Wynik podaje się w jednostkach Wohlgemutha, oznaczających taką aktywność amylazy w 1 ml badanego preparatu, która rozkłada 1 mg skrobi do produktów nie dających zabarwienia z jodem, w ciągu 30 minut, w temperaturze 37C, w obecności jonów chlorkowych.
Wykonanie:
2.4 ml substratu skrobiowego ogrzać do 37C przez wstawienie do łaźni na 10 minut i wprowadzić następnie 0.1 ml preparatu enzymatycznego. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37C przez 30 minut. Dodać 2.5 ml roztworu kwasu sulfosalicylowego. Po kilku minutach przesączyć roztwór do probówki. Równolegle wykonać próbę kontrolną biorąc 2.4 ml substratu, 0.1 ml preparatu enzymatycznego i dodając natychmiast (bez inkubacji) 2.5 ml roztworu kwasu sulfosalicylowego. Przesączyć analogicznie jak poprzednia próbkę.
Do 0.5 ml przesączu próby badanej i kontrolnej wprowadzić (roztwór odmierzony do probówki) 9.5 ml rozcieńczonego 150-krotnie roztworu jodu. Oznaczyć wartość absorbancji przy długości fali 560 nm wobec wody. Odjąć wartość absorbancji próby badanej od wartości absorbancji próby kontrolnej i z krzywej kalibracyjnej odczytać wynik w jednostkach Wohlgemutha.
Wykreślenie krzywej kalibracyjnej.
Do 0.1 ml roztworów wzorcowych zawierających 2, 4, 6, 8 i 10 mg skrobi/ml wprowadzić po 0.15 ml 0.9% roztworu NaCl, 0.25 ml roztworu kwasu sulfosalicylowego i 9.5 ml rozcieńczonego 150-krotnie roztworu jodu. Oznaczyć wartość absorbancji wobec wody i wykreślić krzywą, odkładając na osi odciętych jednostki Wohlgemutha.
W poszczególnych probówkach znajdowało się 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 i 1 mg skrobi, a ponieważ do wywołania barwy wychodzi się z 0.5 ml przesączu, co odpowiada 0.01 ml preparatu enzymatycznego, wyniki w jednostkach Wohlgemutha wyniosą: 20,40, 60, 80 i 100.
Wartości fizjologiczne: do 30 j. W. W surowicy, do 40 j. W. W moczu, a w soku trzustkowym 500-1500 j. W.
Zadanie 2. Enzymatyczna degradacja skrobi.
– Sprzęt:
– kolby stożkowe,
– pipety,
– wata,
– sączki karbowane,
– lejki,
– cieplarka,
– kolba okrągłodenna,
– chłodnica zwrotna,
– mieszadło,
– papierki wskaźnikowe,
– waga analityczna.
Materiał i odczynniki:
– preparat enzymatyczny
– skrobia kukurydziana lub ziemniaczana
Wykonanie ćwiczenia:
Hydroliza skrobi:
W kolbie stożkowej o pojemności 100-250 ml, umieścić 5g skrobi kukurydzianej lub ziemniaczanej, dodać 50 ml wody destylowanej i 0.5 ml preparatu enzymatycznego. Zawartość kolby ogrzewać do zżelowania w łaźni o temperaturze 80ºC. Następnie całość ochłodzić i dodać 1 ml preparatu enzymatycznego. Kolbkę zatkać korkiem z waty i mieszać jej zawartość przez 3 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie wstawić kolbkę do cieplarki ustawionej na 37oC i pozostawić na 24-72h. Następnie zawartość kolbki ogrzać do wrzenia w celu zdenaturowania enzymu, a po ochłodzeniu przesączyć zawartość kolbki, a objętość uzyskanego przesączu dokładnie zmierzyć (będzie to potrzebne do obliczenia sumarycznej ilości cukrów redukujących), pobrać próbki do oznaczenia cukrów redukujących (dwie próbki po 0.5 ml) . Pozostałą ilość przesączu zatężyć w zważonej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej i określić masę pozostałości.
Zadanie 3. Oznaczanie cukrów redukujących metodą Somogyi.
Sprzęt:
– kolby stożkowe,
– pipety,
– lejki,
– biureta,
– łaźnia wodna,
– waga analityczna.
Materiał i odczynniki:
– odczynnik Somogyi:
– Roztwór A- 15 g winianu sodowo-potasowego i 15 g bezwodnego węglanu sodu rozpuścić w 100 ml gorącej wody i dodać 40 ml 1 N NaOH.
– Roztwór B- 4 g pięciowodnego siarczanu miedzi rozpuścić w 40 ml wody i ogrzać do wrzenia
– Roztwór C- 90 g bezwodnego siarczanu sodu rozpuścić w 250 ml wody
Roztwory A, B i C połączyć ze sobą, dodać 4 g jodku potasu oraz 0.6 g jodanu potasu w 10 ml wody. Wymieszać i uzupełnić wodą do 500 ml. – 0.01 N tiosiarczan sodu. Przygotować bezpośrednio przed użyciem przez dziesięciokrotne rozcieńczenie 0.1 N mianowanego roztworu tiosiarczanu.
– 1 M kwas siarkowy
– wskaźnik skrobiowy. 500 mg skrobi rozpuszczalnej rozpuścić w 50 ml wody ogrzewając całość do wrzenia. Po ochłodzeniu dodać 15 g chlorku sodowego.
– glukoza. 100 mg glukozy rozpuścić w 100 ml wody destylowanej (w kolbie miarowej). Do wykonania krzywej wzorcowej pobierać odpowiednio: 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 i 2.0 ml tego roztworu.
Wykonanie ćwiczenia:
Do kolby stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej badany roztwór (0.5 ml) dodać 5 ml odczynnika Somogyi i po dokładnym wymieszaniu zawartość ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. Po wyjęciu z łaźni próbkę ochłodzić pod bieżącą wodą. Następnie dodać 2 ml 1M kwasu siarkowego i wstrząsnąć energicznie aż do rozpuszczenia osadu. Po upływie 5 minut zawartość probówek zmiareczkować 0.01 N tiosiarczanem sodu wobec wskaźnika skrobiowego. Równolegle wykonać dwie próby kontrolne (zawierające wodę destylowaną zamiast badanego roztworu).
Zawartość cukrów redukujących w próbach badanych odczytać z krzywej wzorcowej. Aby sporządzić taką krzywą, należy wykonać w opisany powyżej sposób serię oznaczeń dla prób wzorcowych zawierających 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 i 2.0 mg glukozy w próbce. Wykreślić zależność pomiędzy ilością cukru w próbie badanej (w mg) a różnicą zużycia roztworu tiosiarczanu na zmiareczkowanie próby kontrolnej i badanej (w ml).
Po odczytaniu z krzywej wzorcowej ilości cukrów redukujących w pobranej próbce przeliczyć, jaka jest ich zawartość w całej objętości roztworu. Wynik uzyskany z oznaczania ilości cukrów redukujących porównać z masą uzyskaną po zatężeniu przesączy. Przeanalizować uzyskane wyniki i wyjaśnić ewentualne różnice pomiędzy masą uzyskaną z obliczeń i masą uzyskaną w wyniku zatężania.
