PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Uniwersytet Gdański (www)
Wydział Chemii (www)
Katedry Chemii Bioorganicznej (www)
Kierownik: Prof. dr hab. Krzysztof Rolka
Adres:
ul. Sobieskiego 18/19
80-952 Gdańsk
Kontakt: tel. 58 52 35 386
____________________________________________________________________________
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny do analizy fizykochemicznej peptydów:
1. 1 mg badanego peptydu
2. Płytki chromatograficzne (10×20 cm) pokryte 0,25 mm warstwą żelu krzemionkowego
3. Układ rozwijający: BAWP (alkohol n-butylowy : kwas octowy : woda : pirydyna) o następującym składzie 1 : 1 : 1 : 1 (v/v/v/v)
4. Układ wywołujący: 1% roztwór ninhydryny w etanolu
5. Komora chromatograficzna do chromatografii cienkowarstwowej (TLC)
6. Kapilary
7. Kolba płaskodenna o pojemności 100 mL
8. Zestaw do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) wyposażony w kolumnę do rozdziału w układzie faz odwróconych (C8)
9. 0,1 % roztwór kwasu trifluorooctowego (TFA) w wodzie (roztwór A)
10. 80% roztwór acetonitrylu (ACN) w roztworze A (roztwór B)
11. Strzykawka do HPLC o pojemności 50 µL
12. Probówki Eppendorfa
Wykonanie doświadczenia:
Analiza HPLC peptydu
W probówce Eppendorfa, rozpuścić 1 mg peptydu w wodzie z dodatkiem 0,1% TFA. Następnie pobrać z probówki 50 µL roztworu w celu wykonania analizy HPLC. Peptyd poddać analizie stosując metodę z wykorzystaniem liniowego gradientu 20-80% roztworu B w ciągu 30 minut. Na podstawie otrzymanego chromatogramu określić objętość martwą kolumny oraz czas retencji analizowanego peptydu. Określić czystość peptydu, wyznaczyć współczynnik retencyjny k’ oraz ilość półek teoretycznych kolumny.
Analiza jonu masowego (MS) i analiza elementarna peptydu
Pobrać z probówki kolejne 50 µL rozpuszczonego peptydu i wykonać analizę jonu masowego w pracowni analiz fizykochemicznych. Przeprowadzić również analizę elementarną otrzymanego peptydu.
Analiza peptydu z wykorzystaniem chromatografii cienkowarstwowej (TLC)
Na płytce chromatograficznej (podczas wszystkich operacji należy unikać dotykania złoża płytki palcami) w od1eg1ości 1 cm od brzegu narysować delikatnie miękkim ołówkiem linię, na której co 1,5 cm zaznaczyć punkty. W oznaczonych punktach nanieść kapilarą w kilku różnych objętościach roztwór peptydu. Odparować (do sucha) rozpuszczalniki strumieniem zimnego powietrza z suszarki do włosów. Włożyć płytkę do komory chromatograficznej nasyconej parami układu rozwijającego i pozostawić do momentu, gdy czoło układu rozwijającego osiągnie poziom około 2 cm od przeciwległego końca płytki. Po wyjęciu płytki z komory chromatograficznej niezwłocznie zaznaczyć ołówkiem poziom czoła układu rozwijającego, a następnie dokładnie wysuszyć płytkę za pomocą suszarki do włosów i spryskać (pod włączonym wyciągiem!) układem wywołującym (1% roztwór ninhydryny w etanolu) i ogrzewać. Na podstawie położenia pojawiających się plamek obliczyć wartości współczynników podziału (Rf) dla badanych peptydów.
