PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Tytuł oryginalny: Wyodrębnianie RNA z drożdży
<img src=”http://e-biotechnologia.pl/obrazki/chemia.jpg” ALIGN=”left” alt=”Wydział Chemii UG” HSPACE=33 VSPACE=22/> Uniwersytet Gdański (www)
Wydział Chemii (www)
Katedry Chemii Bioorganicznej (www)
Kierownik: Prof. dr hab. Krzysztof Rolka
Adres:
ul. Sobieskiego 18/19
80-952 Gdańsk
Kontakt: tel. 58 52 35 386
____________________________________________________________________________
Kwas rybonukleinowy RNA można wyekstrahować ze zhomogenizowanych komórek drożdży za pomocą 2% roztworu soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS). Tak otrzymany ekstrakt zawiera niewielkie ilości kwasu DNA (<0,5%) oraz białka (<2,0%).
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny.
1. Świeże komórki drożdży
2. 2% roztwór SDS (soli sodowej siarczanu dodecylu)
3. 2 M roztwór NaOH
4. 2 M roztwór HCl
5. 95% Etanol
6. Roztwór octanu potasu (200 g/L, pH 5,0)
7. 0,2 M roztwór NaOH
8. Wirówka
9. Probówki wirówkowe
10. Probówki zwykłe szklane
11. Łaźnia wodna
12. Kolby płaskodenne i okrągłodenne
13. Cylindry miarowe
14. Zlewki
Izolacja RNA z drożdży
Izolację RNA należy prowadzić w rękawiczkach. W erlenmajerce doprowadzić do wrzenia 30 mL 2% roztworu soli sodowej siarczanu dodecylu. Do wrzącego roztworu dodać 10 g rozdrobnionych świeżych drożdży i zawartość ogrzewać przez 3 minuty. Następnie kolbę schłodzić strumieniem zimnej wody z kranu, przenieść zawartość kolby do probówki wirówkowej i odwirować przez 10 minut przy 6000 RPM. Supernatant przenieść do erlenmajerki, dodać taką objętość octanu potasu, aby końcowe stężenie soli wynosiło 20 g/L, a następnie dwie objętości etanolu. Mieszaninę z wytrąconym RNA pozostawić na łaźni lodowej przez 0,5 godziny, a następnie odwirować przez 6 minut przy 6000 RPM. Roztwór znad osadu zdekantować, zaś otrzymany osad RNA rozpuścić w 10 mL 0,2 M roztworu NaOH. Tak otrzymany roztwór RNA zawiera stosunkowo dużą frakcję białkową, którą można dalej oddzielić na drodze chromatograficznej.
Oszacowanie zawartości RNA i białek
Zawartość RNA i białek można oszacować wykorzystując charakterystyczne dla tych grup związków pasma absorbcji w ultrafiolecie. Kwasy nukleinowe wykazują maksimum absorbcji przy 260 nm. Empirycznie stwierdzono, że A260=1 odpowiada stężeniu około 50 µg/mL. Podobnie dla białek, wykorzystując ich charakterystyczne pasma absorbcji w ultrafiolecie, wyznaczono empirycznie kilka wzorów, pozwalających na oszacowanie ich stężenia. Kilka z nich przedstawiono poniżej:
C (mg/mL) = 0,4 (A235 – A280 )
C (mg/mL) = 1,55 A280 – 0,76 A260
C (mg/mL) = 0,144 (A215 – A225)
Na podstawie pomiarów absorbcji charakterystycznych pasm dla białek i kwasów nukleinowych oszacować zawartość obydwu grup związków w wyizolowanym preparacie.
Określenie rozpuszczalności RNA
– w roztworach kwasów i zasad
Z otrzymanego w poprzednim doświadczeniu roztworu RNA w 0,2 M roztworze NaOH (rybonukleinianu sodu) pobrać 1 mL, umieścić w probówce szklanej, a następnie dodawać kroplami 2 M roztwór HCl. Zaobserwować wytrącanie się RNA. Następnie do tej samej probówki ponownie dodawać kroplami 2 M roztwór NaOH. Zaobserwować rozpuszczanie osadu.
– w etanolu
Z otrzymanego w poprzednim doświadczeniu roztworu RNA w 0,2 M roztworze NaOH (rybonukleinianu sodu) pobrać 1 mL, umieścić w probówce szklanej, a następnie dodawać kroplami etanol. Opisać pojawiające się w probówce zmiany.
