Polimerazy DNA są enzymami katalizującymi syntezę DNA. W komórce pełnią istotną rolę np. podczas replikacji. Substratami niezbędnymi do działania polimeraz są nukleotydy (w PCR: dNTP). Synteza DNA odbywa się na matrycy, którą jest jednoniciowa cząsteczka DNA. Synteza ta odbywa się od krótkiego, komplementarnego odcinka DNA zwanego starterem (określany też jako primer).
Rys. 1. Struktura polimerazy DNA
DNA Polimeraza I – polimeraza Kornberga
Enzym ten otrzymano z E.coli. Jest to pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 109 kD
Aktywności Polimerazy Kornberga:
– synteza DNA od końca 5’ do 3’ – wymaga jednoniciowej matrycy oraz startera DNA lub RNA
– egzonukleaza 3’-5’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA
– egzonukleaza 5’-3’- degraduje dwuniciowy DNA lub hybrydy DNA-RNA
Warunki reakcji:
– pH – około 7,4
– niezbędna obecność jonów magnezowych
– 10x stężony bufor o składzie: Tris-HCl, MgCl2, DTT, BSA
DNA Polimeraza I – fragment Klenowa
Enzym ten uzyskuje się na dwa sposoby: poprzez proteolizę polimerazy Kornberga subtilizyną lub z rekombinantów E.coli. Jest to pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 75 kD
Aktywności DNA Polimerazy I (fragment Klenowa):
– synteza DNA od końca 5’ do 3’ – wymaga jednoniciowej matrycy oraz primera DNA lub RNA
– egzonukleaza 3’-5’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA
– brak aktywności egzonukleazy 5’-3’
Warunki reakcji:
– pH – około 7,4
– niezbędna obecność jonów magnezowych
– reakcja w temperaturze pokojowej do 37 stopni C
– 10x stężony bufor o składzie: Tris-HCl, MgCl2, DTT, BSA
DNA Polimeraza I (fragment Klenowa) charakteryzuje się tym, że bardzo często dodaje jeden lub więcej nukleotydów do końca 3’.
Polimeraza Taq
Enzym ten uzyskano z bakterii Thermus aquaticus lub rekombinantów E.coli. Charakterystyczną właściwością tego enzymu jest termostabilnośc w zakresie temperatur 37-94 stopnie C.
Aktywności Polimerazy Taq:
– synteza DNA od końca 5’ do 3’ – wymaga jednoniciowej matrycy oraz startera DNA lub RNA
– egzonukleaza 5’-3’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA
– brak aktywności egzonukleazy 3’-5’
Warunki reakcji:
– pH – około 7,4
– niezbędna obecność jonów magnezowych
– optimum działania przy 80 stopniach C
Polimeraza Taq dodaje jedną adeninę do końca 3’. Charakterystyczne jest również to, że enzym ten popełnia dużo błędów.
Polimeraza faga T4
Enzym ten uzyskano z bakterii E. coli zakażonych fagiem T4 lub z rekombinantów E. coli. Jest to pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 114 kD
Aktywności Polimerazy faga T4:
– synteza DNA od końca 5’ do 3’ – wymaga jednoniciowej matrycy oraz startera DNA lub RNA
– egzonukleaza 3’-5’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA, większa aktywnośc dla nici pojedynczej niż podwójnej
– brak aktywności egzonukleazy 5’-3’
Warunki reakcji:
– pH – około 8,0-9,0
– niezbędna obecność jonów magnezowych (optymalnie 6 mM)
– optimum działania przy 37 stopniach C
– 10x stężony bufor o składzie: Tris-octan, octan magnezu, DTT, octan potasu, BSA.
Polimeraza faga T7
Enzym ten uzyskano z bakterii E. coli zakażonych fagiem T7. Jest to dimer złożony z produktu genu 5 faga T7 o masie84 kD (aktywnośc polimerazy i egzonukleazy) i trioredoksyny E. coli o masie12 kD (wiązanie z matrycą DNA).
Aktywności Polimerazy faga T4:
– synteza DNA od końca 5’ do 3’ – wymaga jednoniciowej matrycy oraz startera DNA lub RNA
– egzonukleaza 3’-5’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA, aktywnośc 1000x większa niż DNA Polimeraza I (fragment Klenowa)!
– brak aktywności egzonukleazy 5’-3’
Warunki reakcji:
– pH – około 7,5
– niezbędna obecność jonów magnezowych
– optimum działania przy 37 stopniach C
– 10x stężony bufor o składzie: Tris-HCl, MgCl2, DTT
