PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Tytuł oryginalny: Oznaczanie zawartości all-trans-retinolu (witaminy A), cholekalcyferolu (witaminy D3) oraz α-tokoferolu (witaminy E) w produktach spożywczych i farmaceutycznych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej
Uniwersytet Gdański (www)
Wydział Chemii (www)
Katedry Chemii Bioorganicznej (www)
Kierownik: Prof. dr hab. Krzysztof Rolka
Adres:
ul. Sobieskiego 18/19
80-952 Gdańsk
Kontakt: tel. 58 52 35 386
____________________________________________________________________________
Ważnymi składnikami pokarmowymi w żywieniu człowieka są substancje egzogenne, zwane witaminami. Nie pełnią one w organizmie funkcji nośników energii lub elementów budulcowych, jednakże są substancjami niezbędnymi dla normalnego przebiegu procesów zachodzących w tkankach.
Witaminy, wchodząc w szlaki przemiany materii, umożliwiają przebieg różnych reakcji biochemicznych. Witaminy wpływają na zachowanie dobrego stanu zdrowia. Ponieważ substancje te nie mogą być wytwarzane przez organizm, muszą być dostarczane z pożywieniem lub w postaci preparatów farmaceutycznych. W organizmie mogą być magazynowane jedynie w niewielkich ilościach.
Z chemicznego punktu widzenia witaminy należą do różnych grup związków organicznych, a jedynie ich znaczenie dla organizmów żywych pozwala opisywać je pod wspólną nazwą.
Tradycyjnie, ze względu na rozpuszczalność, witaminy dzieli się na:
– rozpuszczalne w tłuszczach: witamina A, D, E oraz K,
– rozpuszczalne w wodzie: witamina C i witaminy z grupy B: witamina B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9 oraz B12.
Zasada oznaczenia witamin:
Witaminy są zmydlane w próbkach za pomocą wodnego roztworu wodorotlenku potasu, a następnie ekstrahowane heksanem. Końcowe oznaczenie zawartości witamin wykonywane jest metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w układzie faz odwróconych, z detekcją w ultrafiolecie. Witaminy identyfikowane są na podstawie czasów retencji, a ich zawartość oznaczana jest metodą krzywej wzorcowej.
Odczynniki do oznaczania witamin:
1. Heksan
2. Metanol
3. Bezwodny siarczan sodu
4. Wodorotlenek potasu
5. 2,6-di-t-butylo-4-metylofenol (BHT)
6. Witaminy: A, D3 i E o czystości nie mniejszej niż 95%.
Sprzęt laboratoryjny i pomocniczy:
1. Zestaw do wysokosprawnej chromatografii cieczowej składający się z detektora UV, pompy oraz komputera z oprogramowaniem
2. Spektrofotometr UV-Vis
3. Waga analityczna
4. Moździerz porcelanowy lub homogenizator
5. Łaźnia ultradźwiękowa
6. Wyparka rotacyjna próżniowa
7. Płaszcz grzejny
8. Szkło laboratoryjne: chłodnica zwrotna, kolby okrągłodenne, pipety wielomiarowe, cylindry miarowe, lejki, zlewki, rozdzielacz, kolby stożkowe płaskodenne
9. Sączki
10. Probówki Eppendorfa
Wykonanie doświadczenia:
1. Przygotowanie podstawowych roztworów wzorcowych
W celu przygotowania podstawowych roztworów wzorcowych witamin należy:
a) naważyć około 0,025 g witaminy A i rozpuścić w 50 mL metanolu (stężenie 0,5 mg/mL),
b) naważyć około 0,025 g witaminy D3 i rozpuścić w 25 mL metanolu (stężenie 1 mg/mL),
c) naważyć około 0,04 g witaminy E i rozpuścić w 100 mL metanolu (stężenie 0,4 mg/mL).
Sporządzić takie rozcieńczenia podstawowych roztworów wzorcowych witamin, aby mierzona wartość absorbancji przy długości fali podanej poniżej mieściła się w granicach od 0,1 do 1,0. W tym celu rozcieńczyć podstawowe roztwory wzorcowe witamin A i D3 stukrotnie a witaminy E dziesięciokrotnie (robocze roztwory wzorcowe). Za pomocą spektrofotometru zmierzyć absorbancję roboczych roztworów wzorcowych w kuwecie kwarcowej o długości drogi optycznej 1 cm przy długości fali, przy której poszczególne witaminy wykazują maksymalną absorbancję: 326 nm dla witaminy A, 265 nm dla witaminy D3 oraz 292 nm dla witaminy E. W przypadku witaminy A, w celu sprawdzenia jej czystości należy zmierzyć również wartości absorbancji roztworów przy długościach fal: 300 nm, 350 nm, 370 nm. Jeśli stosunki A300/A326, A350/A326 oraz A370/A326 nie przekraczają wartości odpowiednio 0,602, 0452 oraz 0,093 substancja moŜe być wykorzystana. W przypadku witaminy E należy zmierzyć również absorbancję przy długości fali 255 nm. Witamina ta może być stosowana jeśli wartość E1%1 cm przy tej długości fali mieści się w zakresie od 6 do 8.
Stężenie roboczych roztworów wzorcowych należy obliczyć na podstawie zależności:
gdzie: C – stężenie witaminy wyrażone w µg/ mL, A – absorbancja roztworu, wartości E1%1 cm dla poszczególnych witamin wynoszą: witamina A: 1830, witamina D3: 480, witamina E: 76.
Obliczyć stężenie podstawowych roztworów wzorcowych witamin uwzględniając rozcieńczenie. Z podstawowych roztworów wzorcowych witamin przygotować kontrolny roztwór wzorcowy zawierający 0,5 µg/mL witaminy A, 1 µg/mL witaminy D3 oraz 5 µg/mL witaminy E. Podstawowe roztwory wzorcowe witamin oraz roztwór kontrolny z dodatkiem przeciwutleniacza (BHT) przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Sprawdzenie zakresu liniowości wskazań detektora oraz sporządzenie krzywych wzorcowych
Posługując się metodą przeznaczoną do oznaczania zawartości witamin sprawdzić zakres liniowości wskazań detektora dla każdej z witamin w zakresie różnych poziomów stężeń wzorców. Następnie sporządzić krzywe wzorcowe dla przynajmniej pięciu poziomów stężeń wzorców, mieszczących się w zakresie liniowości wskazań detektora. Do sporządzenia krzywych wzorcowych mogą posłużyć wyniki analiz wykonanych w celu sprawdzenia zakresu liniowości wskazań detektora. Dla poszczególnych witamin wykreślić krzywe wzorcowe przedstawiające zależność powierzchni piku od stężenia wzorca. W celu wykreślenia krzywych wzorcowych należy wybrać funkcje liniowe przechodzące przez 0. Otrzymane wartości współczynników korelacji powinny być większe lub równe 0,995.
3. Zmydlanie badanych próbek
Do kolbki okrągłodennej (o poj. 250 mL) naważyć 0,2 − 2 g badanego produktu spożywczego lub farmaceutycznego (jeśli ciało stałe, to dokładnie rozdrobnionego wcześniej) z dokładnością 0,001 g, dodać 50 mL metanolu oraz około 0,03 g BHT (przeciwutleniacz), a następnie dodać 50 mL wodnego roztworu KOH (25 g KOH na 50 mL roztworu) i rozpocząć zmydlanie pod chłodnicą zwrotną ogrzewając kolbę z mieszaniną za pomocą łaźni elektrycznej. Proces zmydlania prowadzić 40 minut w temperaturze około 70°C. W trakcie zmydlania wstrząsać kolbą reakcyjną tak, aby substancja zmydlana nie przywierała do ścianek naczynia. Po zakończeniu zmydlania kolbę reakcyjną ochłodzić wodą z kranu i przenieść mieszaninę reakcyjną do rozdzielacza (o pojemności 500 mL). Przeprowadzić trzykrotną ekstrakcję heksanem, stosując kolejno następujące objętości heksanu: 100, 60 oraz 40 mL. Połączone ekstrakty heksanowe przemyć trzykrotnie wodą (3×100 mL) do odczynu obojętnego, a następnie usunąć ślady wody za pomocą bezwodnego siarczanu sodu. Ekstrakt przesączyć na sączku i odparować do sucha. Pozostałość rozpuścić w metanolu (np. w 1 mL) i przeprowadzić oznaczenie zawartości witamin z zastosowaniem zestawu do wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Objętość dodanego metanolu powinna być tak dobrana, aby stężenia analitów w uzyskanym ekstrakcie nie przekroczyły zakresu liniowości wskazań detektora.
4. Analiza chromatograficzna
Przed rozpoczęciem właściwej analizy badanej próbki należy wykonać analizę chromatograficzną roztworu kontrolnego i porównać zgodność wyniku z krzywą wzorcową. Otrzymane wyniki powinny mieścić się w zakresie stężeń teoretycznych ±20%. W wypadku braku zgodności wyników należy przygotować nowe roztwory wzorcowe witamin oraz sporządzić nowe krzywe wzorcowe.
Jeśli roztwór kontrolny spełnia powyższe kryterium wykonać analizę próbki. Warunki analizy:
– chromatograf cieczowy składający się z pompy Knauer K-1001 i detektora UV Knauer K-2001;
– kolumna Beckman ODS (5 µm), o wymiarach 150×4,6 mm;
– objętość dozowania 50 µl;
– temperatura kolumny 25°C;
– faza ruchoma MeOH : H2O (92 : 8; v/v);
– natężenie przepływu fazy ruchomej 1 mL/min;
– czas analizy 20 min;
– warunki detekcji:
1. witamina A λ = 325 nm (od 0 do 6 minuty),
2. witamina D3 λ = 254 nm (od 6 do 13 minuty),
3. witamina E λ = 280 nm (od 13 do 20 minuty);
5. Przedstawienie wyników końcowych
Na podstawie czasów retencji zidentyfikować witaminy w badanej próbce, a ich zawartość wyznaczyć na podstawie powierzchni pików. Wynik końcowy oznaczenia przedstawić w µg/100g oraz w IU/100 g próbki z dokładnością do 0,001. W celu przeliczenia otrzymanych wyników analiz na jednostki międzynarodowe (IU) należy zastosować następujące przeliczniki:
