Opracowała: Ewa Balczerowska
Od 20 lat w laboratoryjnych szklarniach prowadzone są próby modyfikacji koloru kwiatów z wykorzystaniem technik inżynierii genetycznych. Starania te dotyczą zarówno gatunków roślin doniczkowych jak i ciętych, a ich celem jest wytworzenie nowych, transgenicznych odmian o barwie płatków nie występującej naturalnie ani nie dającej się uzyskać poprzez tradycyjne krzyżowanie, a przez to atrakcyjnej dla konsumenta.
W jaki sposób można wpływać na zmianę barwy kwiatów rośliny?
Wśród setek barwników roślinnych wyróżnia się trzy główne grupy związków chemicznych – są to: karotenoidy, betalainy oraz flawonoidy. Ostatnia z nich ma największy wpływ na ostateczny kolor kwiatów. Substancje te są magazynowane w dużych ilościach w wakuolach, głównie wewnątrz komórek epidermalnych płatków kwiatów. Do flawonoidów należy wiele klas związków, takich jak antocyjaniny (odpowiedzialne za kolor pomarańczowy, czerwony, purpurowy, fioletowy i niebieski), aurony i chalkony (żółty) oraz flawony i flawonole (przez ludzkie oko postrzegane jako bezbarwne lub bladożółte). Prowadzone do tej pory badania skupiały się na manipulacjach w obrębie genów i produktów genów zaangażowanych w prawidłowy przebieg szlaków biosyntezy antocyjanin. Jest to olbrzymia grupa związków organicznych, stanowiących pochodne jednej z trzech głównych antocyjanidyn: pelargonidyny, cyjanidyny lub delfinidyny. Kwiaty niebieskie powstają zazwyczaj w wyniku nagromadzenia antocyjanin syntetyzowanych na bazie delfinidyny, natomiast intensywnie czerwone – pelargonidyny.
W strukturze antocyjanidyn występują trzy pierścienie aromatyczne. Mogą one ulegać modyfikacjom chemicznym w różnych pozycjach, co bezpośrednio przyczynia się do zmiany barwy kwiatów. Dotyczy to szczególnie pozycji 3’ i 5’ pierścienia B antocyjanidyn.
a) Hydroksylacja – jest katalizowana przez dwie monooksygenazy cytochromowe typu P450: 3’-hydroksylazę flawonoidów (F3’H) oraz 3’,5’- hydroksylazę flawonoidów (F3’5’H), które w literaturze nazywane są także (odpowiednio) CYP75B i CYP75A. Wzrost ilości grup hydroksylowych w pierścieniu B flawonoidu wiąże się z przyjmowaniem bardziej niebieskiego koloru przez zawierające go komórki.
b) Glikozylacja – jest przeprowadzana przez dwie grupy enzymów zależnych od UDP-glukozy: 3’-glukozylotransferazę antocyjanidyn (3GT) oraz 5’-glukozylotransferazę antocyjanidyn (5GT). Reakcje glikozylacji zachodzą pojedynczo, najpierw w pozycji 3’ a następnie w pozycji 5’. W ich wyniku powstają 3,5-diglukozydy antocyjanidyn i ich pochodne. U niektórych roślin zdarzają się jednak odstępstwa. U róż (Rosa sp. ) glikozylacja pozycji 5’ pierścienia aromatycznego B poprzedza reakcję katalizowaną w pozycji 3’. U klitorii ternateńskiej (Clitoria ternatea) występuje natomiast 3’,5’-glukozylotransferaza antocyjanidyn (3’,5’-GT). Glikozylowane antocyjaniny wykazują maksimum absorpcji dla krótszych fal, co skutkuje bardziej czerwonym odcieniem płatków kwiatów.
c) Acylacja – jest przeprowadzana przez acylotransferazy antocyjanin zależne od acylo-CoA (5AT), należące do rodziny BAHD. W tym wypadku ten sam enzym katalizuje acylację reszt glukozy w pozycji 3’ i 5’ pierścienia B. Acylacja antocyjanin powoduje zwiększenie ich stabilności oraz zmianę barwy kwiatów na niebieską, natomiast utrata grup acylowych – na purpurową. Jednoczesne występowanie w komórkach płatków kopigmentów w postaci flawonów i flawonoli skutkuje uzyskaniem głębszego odcienia niebieskiego koloru u kwiatów.
d) Metylacja – jest katalizowana przez metylotransferazy antocyjanin zależne od S-adenozylometioniny (MT). Metylacja grup hydroksylowych w pozycjach 3’ i 5’ pierścienia B antocyjanin powoduje „czerwienienie się” zawierających je kwiatów.
Do chwili obecnej za pomocą technik inżynierii genetycznej uzyskiwano zmiany naturalnego koloru płatków, stosując w tym celu różne modyfikacje przebiegu endogennych mechanizmów reakcji hydroksylacji pierścienia B flawonoidów tych gatunków roślin.
Rysunek 1. Schemat przebiegu reakcji szlaków biosyntezy antocyjanin (na podstawie: Tanaka i in., 2010).
Głównym zadaniem podczas prób otrzymania rośliny transgenicznej o pożądanym kolorze kwiatów jest doprowadzenie do nadekspresji genu kodującego kluczowy enzym szlaku syntezy odpowiedniego barwnika. Efekt ten uzyskiwano m. in. poprzez wprowadzenie do genomu modyfikowanej rośliny dodatkowego genu kodującego ten enzym i/lub specyficzny względem niego czynnik transkrypcyjny o charakterze aktywatora. W obu wypadkach transgen powinien być zaopatrzony w promotor zapewniający zwiększony poziom transkrypcji oraz odpowiednią specyficzność tkankową jego ekspresji. Jednak najczęściej nie wystarczało to do uzyskania rośliny o zmienionym kolorze płatków. Należy pamiętać o konieczności jednoczesnego zminimalizowania zjawiska kompetycji o substrat enzymów występujących w tkance endogennie z enzymami celowo wprowadzanymi. Można tego uniknąć poprzez wyciszenie aktywności genów kodujących białka zaangażowane w szlak biosyntezy konkurencyjnego barwnika bądź inhibicję produktów tych genów.
Pomocna okazuje się znajomość czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w procesy, które zamierzamy modyfikować, a także ich dostępność w komórkach tkanki, którą zamierzamy poddać transgenizacji. U wielu gatunków, takich jak petunia (Petunia sp. ), lwia paszcza (Antirrhinum sp. ) i rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana), stwierdzono obecność kompleksu MBW, biorącego udział w aktywacji transkrypcji genów szlaku biosyntezy flawonoidów. Jest on zbudowany z dwóch czynników transkrypcyjnych: bHLH i R2R3-MYB, których zadaniem jest wiązanie specyficznych sekwencji regulatorowych oraz czynnika WD40, wzmacniającego interakcje białko-białko.
Ważnym elementem jest selekcja odpowiednich roślin wyjściowych, które będą poddawane transformacji. Świadomy wybór powinien dotyczyć nie tylko gatunku (np. ze względu na cechy użyteczne komercyjnie), ale także poszczególnych osobników w ramach gatunku/odmiany, ze względu na posiadany przez nie genom oraz metabolon. Często wykorzystuje się naturalne mutanty, różniące się od typowych osobników danej odmiany, np. takie, które nie wykazują endogennej aktywności enzymu, który mógłby zakłócać ostateczny efekt barwny. Materiał wyjściowy bardzo często stanowią rośliny wytwarzające białe kwiaty pozbawione kopigmentów. Osobniki takie z konieczności można otrzymać także na drodze inżynierii genetycznej, poprzez „knock-out” genów kodujących enzymy szlaków biosyntezy antocyjanin bądź zahamowanie ich transkrypcji. W tym celu wykorzystywano do tej pory dwie metody: interferencję RNA (RNAi) oraz bezpośrednią modyfikację genomu z udziałem nukleaz posiadających domeny o strukturze palców cynkowych. W pierwszym wypadku otrzymywany fenotyp nie zawsze był stabilny w kolejnych pokoleniach.
Zdarza się, że akumulacja antocyjaniny o właściwym kolorze nie prowadzi do zmiany barwy kwiatów rośliny. Należy brać pod uwagę, że na ich ostateczny kolor mają wpływ również czynniki dotyczące m. in. warunków fizyko-chemicznych panujących w tkance, takie jak:
– struktura, rodzaj i stężenie antocyjaniny,
– obecność kopigmentów,
– rodzaj i stężenie jonów metali,
– pH wakuoli,
– lokalizacja komórkowa antocyjaniny,
– kształt powierzchni komórek.
Czynniki te wydają się stanowić dodatkowe utrudnienie zadania jakim jest modyfikacja barwy kwiatów, jednak odpowiednio wykorzystana wiedza na ich temat może znacznie poszerzyć dostępne możliwości manipulowania genomem rośliny, a przez to spowodować uzyskanie zamierzonego celu. Pewne purpurowe odmiany tulipana mają u nasady kwiatów bardziej niebieski odcień, pomimo tego, że stężenie antocyjanin (pochodnych delfinidyny) oraz flawonoli jest we wszystkich komórkach płatków jednakowe. Zjawisko to jest spowodowane 25-krotnie większym stężeniem jonów żelaza w dolnej części kwiatów. Jest to skutek ekspresji błonowego białka TgVitl transportującego jony żelaza z jednoczesną supresją genu TgFer1, kodującego ferrytynę. Ważna jest także umiejętność manipulowania pH wakuoli w komórkach płatków kwiatów za pomocą kontroli ekspresji genów kodujących błonowe pompy jonowe. Intensywnie czerwone róże charakteryzują się niższym pH wakuoli (~4.0). Dzikie odmiany pelargonii z tego samego powodu nie przyjmują fioletowych ani niebieskich odcieni, pomimo syntetyzowanych w płatkach znacznych ilości antocyjanin będących pochodnymi delfinidyny. Dobry przykład może stanowić przetacznik (Veronica), który naturalnie występuje w różnych odmianach barwnych, zależnie od pH wakuoli: od purpurowej (pH 5) przez fioletową (pH6), po niebieską (pH7).
Przykłady modyfikacji genetycznych prowadzących do zmiany koloru kwiatów.
Pierwszym udanym, bo stosunkowo prostym eksperymentem było wywołanie ekspresji genu DFR (kodującego reduktazę dihydroflawonolową) kukurydzy u petunii, która nie posiadała funkcjonalnych białek F3’H i F3’5’H, co zaowocowało wzmożoną syntezą antocyjanin – pochodnych pelargonidyny.
Brak niebieskich lub fioletowych róż, goździków (Carnation sp. ), chryzantem (Chrysanthemum sp. ) czy lilii (Lilium sp. ) jest spowodowany tym, że rośliny te w naturalny sposób akumulują w płatkach kwiatów pochodne pelargonidyny i cyjanidyny, natomiast powodu braku endogennej aktywności enzymu F3’5’H nie syntetyzują pochodnych delfinidyny.
Pierwsze na świecie, genetycznie modyfikowane pod względem koloru płatków, kwiaty cięte wprowadzone na rynek, stanowią goździki z serii Moon. Początkowo, w wyniku wywołania nadekspresji F3’5’H petunii pod kontrolą konstytutywnego promotora, uzyskano zaledwie niewielką zmianę barwy płatków z wyjściowej na bardziej niebieską. Dopiero jednoczesna likwidacja kompetycji o substrat dwóch kluczowych endogennych enzymów (DFR i F3’H) z wprowadzonym egzogennie F3’5’H zaowocowała wzrostem ilości akumulowanych w komórkach kwiatów pochodnych delfinidyny. W kolejnych doświadczeniach wykorzystano białe goździki (nie wykazujące endogennej aktywności DFR), w których wywołano ekspresję F3’5’H pod promotorem genu CHS (kodującego syntazę chalkonową) lwiej paszczy oraz ekspresję DFR petunii pod promotorem konstytutywnym. Otrzymana odmiana charakteryzowała się kwiatami o spektakularnie zmienionym kolorze i trafiła na rynek jako pierwsza, pod nazwą Moondust. Kolejna, Moonshadow o intensywnie fioletowym kolorze, posiadała wprowadzony gen F3’5’H bratka pod promotorem genu CHS lwiej paszczy oraz DFR-A petunii, zaopatrzony we własne sekwencje promotora i terminatora. Alternatywą okazało się wywołanie u goździków posiadających funkcjonalny enzym DFR ekspresji genów F3’5’H oraz kodującego cytochrom b5, pochodzących z genomu petunii. Odkryto bowiem, że u tego gatunku funkcją cytochromu b5 jest dostarczanie elektronów dla F3’5’H i tym samym znaczące zwiększanie jego wydajności. Mechanizm poprawy transferu elektronów jest na tyle skuteczny, że neutralizuje zjawisko kompetycji o substrat endogennych enzymów F3’H oraz DFR z produktem transgenu F3’5’H, wprowadzonego do genomu goździka.
Kolejnym sukcesem inżynierii genetycznej było otrzymanie fioletowoniebieskich transgenicznych róż (Rosa hybrida). Dzikie gatunki róży mają barwę kwiatów białą lub różową, zawdzięczaną akumulacji w wakuolach komórek płatków antocyjanin pochodzących od cyjanidyny. (Dopiero uzyskane przez człowieka odmiany charakteryzowały się kwiatami w kolorze żółtym (karotenoidy), pomarańczowym i czerwonym (pochodne pelargonidyny). Z nieznanych przyczyn próby wywołania u róży ekspresji genu F3’5’H pochodzącego z genomu petunii, goryczki (Gentiana) i klitorii zakończyły się niepowodzeniem, natomiast wprowadzenie tego samego genu bratka (Viola) zaowocowało uruchomieniem brakującego szlaku syntezy i akumulacją antocyjanin pochodzących od delfinidyny. W dalszych doświadczeniach wykorzystano odmiany róż charakteryzujące się wyższym pH wakuoli, wysokim stężeniem flawonoli (kopigmentów) w komórkach płatków oraz słabą endogenną aktywnością F3’H lub całkowitym jej brakiem. U roślin tych wyciszono następnie gen DFR metodą RNAi i zastąpiono go wprowadzonym egzogennie DFR irysa hiszpańskiego (Iris xiphium). W ten sposób otrzymano osobniki wytwarzające kwiaty o wyraźnie niebieskim odcieniu płatków. Ich pyłek posłużył do przeprowadzenia hybrydyzacji z odmianami o intensywnie czerwonych kwiatach. Potomstwo, poza ciekawym efektem barwnym, charakteryzowało się jednak zahamowanym wzrostem.
Wiele z przeprowadzanych doświadczeń miało na celu uzyskanie roślin o atrakcyjnych, intensywnie czerwonych lub pomarańczowych kwiatach, będących wynikiem magazynowania w komórkach płatków antocyjanin syntetyzowanych na bazie pelargonidyny. W przypadku petunii, której naturalne odmiany zawdzięczają swój kolor obecności pochodnych cyjanidyny, w celu zmiany barwy kwiatów wyciszono aktywność F3’H z jednoczesnym wprowadzeniem DFR róży i wywołaniem jego nadekspresji. Podobny efekt u tytoniu (Tobacco) został wywołany dzięki wyciszeniu ekspresji endogennego F3’H i genu kodującego syntazę flawonolową (FLS) z jednoczesnym wywołaniem nadekspresji DFR pochodzącego z gerbery (Gerbera). U stokrotki afrykańskiej (Osteospermum) nadekspresja tego samego transgenu okazała się jednak niewystarczająca i musiało jej towarzyszyć wyciszenie ekspresji endogennego F3’5’H.
U goryczki wyciszenie F3’5’H i genu kodującego 5’3’- acetylotransferazę antocyjanin spowodowało zmianę barwy kwiatów z niebieskiej na różową, co było związane z akumulacją w komórkach płatków nieacylowanych glikozydów cyjanidyn. Także dzikie odmiany Nierembergii (Nierembergia scoparia), o naturalnie białych lub fioletowych kwiatach, posłużyły do wytworzenia osobników o kwiatach różowych, w których gromadzone były antocyjanidyny pochodzące od pelargonidyny. Efekt ten uzyskano wyciszając ekspresję endogennych genów kodujących F3’5’H i FLS z jednoczesnym wywołaniem nadekspresji różanego genu DFR. Zahamowanie aktywności F3’5’H z jednoczesną nadekspresją różanego DFR u Nierembergii prowadziło jedynie do wytwarzania białych kwiatów – było to prawdopodobnie spowodowane zbyt słabą aktywnością F3’H oraz zbyt silną aktywnością FLS.
Podobne zasady rządzą mechanizmami powodującymi odmienną barwę kwiatów u naturalnie występujących w przyrodzie odmian tego samego bądź blisko spokrewnionych gatunków. U wilca (Ipomoea) wykryto gen Mg (locus magenta), którego produkt bierze udział w regulacji przebiegu 3’ hydroksylacji flawonoidów. Dzika odmiana Ipomoea nil charakteryzuje się niebieskimi kwiatami, zapylanymi przez pszczoły i zawdzięczanymi akumulacji w płatkach pochodnych peonidyny (której prekursor stanowi cyjanidyna). U mutanta Mg występujące w obrębie genu substytucje nukleotydowe generują wcześniejszy kodon stop, skutkiem czego powstaje niefunkcjonalne białko F3’H. Efektem jest gromadzenie się w wakuolach komórek innych antocyjanin – pochodzących od pelargonidyny, powodujących purpurową barwę kwiatów, które są zapylane przez kolibry. U Ipomoea purplea podobny skutek został wywołany insercją transpozonu w obrębie genu kodującego F3’H, natomiast u Ipomoea. quamoclit – utratą aktywności DFR. Dzika odmiana Gentiana scabra charakteryzuje się niebieskimi płatkami kwiatów, w komórkach których syntetyzowane są pochodne delfinidyny. Insercja transpozonu w obrębie genu F3’5’H powoduje jednak zmianę kierunku szlaku biosyntezy i tworzenie się pochodnych cyjanidyny, co prowadzi w konsekwencji do zmiany barwy wytwarzanych kwiatów na różową.
Uzyskiwanie roślin o zmodyfikowanym kolorze kwiatów jest procesem pracochłonnym i długotrwałym, a na ostateczny sukces wpływa wiele czynników. Konieczna jest izolacja użytecznych genów, a następnie opracowanie optymalnej, efektywnej metody transformacji rośliny docelowej oraz zapewnienie właściwej regulacji poziomu ekspresji transgenu. Tradycyjne metody pozwalają krzyżować ze sobą tylko rośliny należące do tego samego gatunku, co nie umożliwia znaczącego poszerzenie wachlarza dostępnych kolorów. Zaletą stosowania w tym celu metod inżynierii genetycznej jest sposobność do uniezależnienia się od tych ograniczeń. Dodatkowo rozpowszechnianie odmian znanych i lubianych kwiatów w nowych kolorach może przyczynić się do popularyzacji organizmów genetycznie modyfikowanych i ogólnej poprawy społecznego nastawienia. Barwniki, których dotyczą opisywane manipulacje, występują powszechnie zarówno u roślin ozdobnych jak i jadalnych, a ponad dziesięcioletnia praktyka uprawy i sprzedaży pierwszych tego typu odmian na świecie udowodniła, że rośliny o genetycznie zmodyfikowanej barwie kwiatów nie stanowią zagrożenia dla zdrowia ani dla środowiska.
Na podstawie:
• Y. Tanaka, F. Brugliera, S. Chandler, Recent Progress of Flower Colour Modification by Biotechnology, International Journal of Molecular Sciences, 2009, 10, s. 5350-5369
• Y. Tanaka, F. Brugliera, G. Kalc, M. Senior, B. Dyson, N. Nakamura, Y. Katsumoto, S. Chandler, Flower Color Modification by Engineering of the Flavonoid Biosynthetic Pathway: Practical Perspectives, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2010, 74 (9), s. 1760-1769
• www.florigene.com, [dostęp z dnia 20. 03. 2011 r.].
• Źródło zdjęcia: http://www.telegraph.co.uk/news/worldnews/1577586/My-love-is-like-a-blue-blue-rose.html
