PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Politechnika Śląska (www)
Wydział Chemiczny (www)
Katedra Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii (www)
Kierownik Katedry: dr hab. inż. Mirosław Gibas prof. Politechniki Śląskiej
Adres:
ul. B. Krzywoustego 4
44-100 Gliwice
Hydrolazy glikozydowe to grupa enzymów powodujących hydrolizę wiązań glikozydowych. Do najpowszechniej występujących enzymów w tej podgrupie należą amylazy. Przeprowadzają one hydrolizę skrobi, wielocukru złożonego z jednostek D-glukozy, połączonych wiązaniem glikozydowym. alfa-amylazy rozrywają wiązania położone wewnątrz cząsteczki.
Przebieg procesu degradacji skrobi można śledzić obserwując zmianę barwy roztworu skrobi traktowanego jodem od niebieskiej (kompleks ze skrobią), poprzez fiołkową, czerwoną (kompleks z erytrodekstrynami) do bezbarwnej (utworzenie cukrów o niskim ciężarze cząsteczkowym). W czasie procesu rośnie zawartość cukrów redukujących, produktów hydrolizy skrobi i określając ich zawartość można śledzić przebieg reakcji. Obecność cukrów redukujących można również stwierdzić wobec odczynnika Benedicta. Próba Benedicta należy do najbardziej swoistych i czułych prób redukcyjnych na cukry. Już 0,1% stężenie cukru redukującego powoduje zmianę barwy z niebieskiej na zieloną. W zależności od ilości glukozy powstaje albo tylko zielone zabarwienie, albo osad żółty, pomarańczowy czy czerwony.
U człowieka enzym alfa-amylaza występuje w ślinie, trzustce, surowicy krwi i moczu. Amylaza śliny i trzustki wykazuje aktywność w roztworach lekko zasadowych, obojętnych i słabo kwasowych. Optymalne pH działania: 6,6. Bardzo duży wpływ na działanie amylazy śliny wywierają elektrolity (Cl-, Br-).
Wykonanie ćwiczenia
Sprzęt:
– statyw z probówkami,
– pipety,
– łaźnie wodne o temperaturze 0 oC, 18 oC, 37 oC, 45 oC, 60 oC.
Materiał i odczynniki:
– 0,5% roztwór skrobi,
– bufor fosforanowy pH 6,6,
– 1% roztwór NaCl,
– odczynnik Lugola (roztwór I2 w KI)
– 1M HCl,
– 1M NaOH.
Zadanie 1. Oznaczanie aktywności alfa-amylazy w ślinie.
Przygotować statyw z probówkami zawierającymi po 0,5 ml odczynnika Lugola i 0,5 ml 1M HCl.
W kalibrowanej probówce (1) zebrać około 2 ml śliny i rozcieńczyć ją wodą do objętości 20 ml, wymieszać i odstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37oC.
Do zwykłej probówki (2) odmierzyć: 5 ml skrobi, 2 ml 1% roztworu NaCl, 2 ml buforu fosforanowego, zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37oC na 5 minut.
Po 5 minutach do probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać, zanotować czas i ponownie wstawić do łaźni wodnej. W krótkich odstępach czasu (od 30s do 3 min) do probówek w statywie, zawierających płyn Lugola, wprowadzać pipetą próbki hydrolizatu z probówki (2). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy jodu- punkt achromowy.
Podać aktywność amylazy w ślinie w jednostkach / ml. W tym ćwiczeniu za jednostkę aktywności amylazy przyjmujemy taką ilość enzymu, która hydrolizuje 25 mg skrobi w czasie 10 minut w temperaturze 37oC, w pH 6,6 w obecności jonów chlorkowych do produktów nie dających barwy z jodem – punkt achromowy.
Przykład obliczenia:
Jeśli do oznaczenie pobrano 1 ml stokrotnie rozcieńczonej śliny, a punkt achromowy osiągnięto po 8 minutach to aktywność amylazy wynosi: 10/8 x 100 = 125 jednostek / ml.
Zadanie 2. Wpływ jonów chlorkowych na aktywność alfa-amylazy.
Jon chlorkowy jest aktywatorem alfa-amylazy. Oznaczyć punkt achromowy jak w zadaniu 1 zastępując w probówce (2) chlorek sodu wodą destylowaną.
Zadanie 3. Wpływ temperatury na aktywność alfa-amylazy.
Do czterech probówek odmierzyć po 5 ml skrobi, 2 ml buforu i 2 ml NaCl. Każdą probówkę umieścić w innej łaźni i po 5 minutach dodać do każdej po 1 ml roztworu śliny, zamieszać i oznaczyć punkty achromowe analogicznie jak w zadaniu 1.
Podać optymalna temperaturę dla alfa-amylazy.
Zadanie 4. Wpływ silnych kwasów i zasad na aktywność alfa-amylazy.
Do trzech probówek odmierzyć po 1 ml roztworu śliny. Do pierwszej dodać 1 ml wody, do drugiej 1 ml 1M HCl, do trzeciej 1 ml 1M NaOH, zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC. Po 15 minutach zawartość probówek zobojętnić wobec papierka wskaźnikowego (odpowiednio zasadą sodową lub kwasem solnym) i uzupełnić objętość buforem do 5 ml. Do trzech następnych probówek odmierzyć po 2 ml skrobi, 1 ml NaCl, 1 ml buforu pH 6,6. Do pierwszej probówki dodać 1 ml śliny rozcieńczonej wodą, do drugiej 1 ml śliny traktowanej kwasem, a do trzeciej 1 ml śliny traktowanej zasadą. Probówki ponownie umieścić w łaźni wodnej i oznaczyć aktywność alfa-amylazy.
