PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Laboratorium z chemii związków naturalnych
Politechnika Śląska (www)
Wydział Chemiczny (www)
Katedra Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii (www)
Kierownik Katedry: dr hab. inż. Mirosław Gibas prof. Politechniki Śląskiej
Adres:
ul. B. Krzywoustego 4
44-100 Gliwice
Opisana poniżej metoda wydzielania lecytyny z jaj kurzych polega na szybkim odwodnieniu żółtek bezwodnym acetonem, przy czym równocześnie następuje usunięcie karotenoidów, glicerydów i innych lipidów obojętnych. Z odwodnionego materiału ekstrahuje się fosfolipidy mieszaniną chloroformu i metanolu. Otrzymaną surową frakcję fosfolipidów oczyszcza się przez rozpuszczenie w eterze dietylowym i ponowne wytrącenie acetonem. Tak otrzymany preparat zawiera, obok fosfatydylocholiny, mniejsze ilości innych fosfolipidów (fosfatydyloserynę i fosfatydyloetanoloaminę) oraz sfingolipidów. Dalsze oczyszczanie preparatu można uzyskać w wyniku chromatografii kolumnowej na tlenku glinu. Czystość otrzymanych preparatów można określić za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.
Otrzymanie preparatu lecytyny.
Sprzęt i akcesoria:
– mieszadła magnetyczne
– kolbki stożkowe z korkami
– lejki
– kolbki ssawkowe
– sączki
– wyparka próżniowa
– wirówka
Materiał i odczynniki:
– jaja kurze –2 sztuki
– aceton
– metanol
– chloroform
– eter dietylowy
Wykonanie ćwiczenia:
Żółtka z 2 jaj przenieść do dwóch kolbek stożkowych na 250 ml (po jednym żółtku do kolbki), dodać po 30 ml acetonu ochłodzonego do 6°C i mieszać na mieszadle magnetycznym przez minutę. Mieszaninę z każdej kolbki odsączyć na osobnym lejku Büchnera, a osady przenieść do kolbek i ponownie zadać po 30 ml zimnego acetonu.
Mieszać minutę i odsączyć. Operację powtórzyć w sumie pięć razy. W rezultacie otrzymuje się sumarycznie około 20 g białego osadu.
Osad przenieść ponownie do 2 kolbek stożkowych i do każdej dodać 60 ml mieszaniny złożonej z 250 ml metanolu i 50 ml chloroformu (metanol:chloroform 5:1) . Kolbki zatkać korkami, uszczelnić parafilmem, umieścić na mieszadle i mieszać przez 1h. Po tym czasie podzielić pomiędzy dwie sekcje, odsączyć osady z kolbek, a przesącze przenieść odpowiednio do dwóch zważonych kolbek okrągłodennych i oddestylować do sucha na wyparce próżniowej w temperaturze nie wyższej niż 40°C. Każdą z otrzymanych pozostałości rozpuścić w 5 ml bezwodnego zimnego eteru, przenieść do probówki Falcona na 50 ml a następnie dodać 45 ml zimnego acetonu. Całość odwirować przy prędkości 6000 (temperatura podczas wirowania 4ºC). Uzyskane po odwirowaniu osady (sumarycznie około 2g) to surowy preparat lecytyny.
Oczyszczanie lecytyny metodą chromatografii kolumnowej.
Sprzęt:
– kolumny chromatograficzne
– komora i płytki do chromatografii cienkowarstwowej
– spryskiwacze do chromatogramów
– odbieralniki
– lampa UV
Materiał i odczynniki:
– surowy preparat lecytyny
– metanol
– chloroform
– tlenek glinu
– płytki TLC
– odczynnik Dragendorffa: Roztwór A- 1.7 g zasadowego azotanu bizmutu rozpuścić w 100 ml 20% kwasu octowego. Roztwór B- 10 g jodku potasu rozpuścić w 25 ml wody. Bezpośrednio przed użyciem zmieszać 20 ml roztworu A z 5 ml roztworu B i dodać 70 ml wody.
– 10% kwas siarkowy w etanolu
Wykonanie ćwiczenia:
Przygotowanie kolumn: tlenek glinu (2 oddzielne naważki po 10g), zawiesić w 30 ml mieszaniny chloroform:metanol (1:1) i dokładnie odpowietrzyć poprzez mieszanie. Na spiek w kolumnie nasypać cienka warstwę piasku, a następnie otrzymane zawiesiny wlewać porcjami po bagietce do kolumny chromatograficznej. Usunąć nadmiar rozpuszczalnika odpuszczając go kranikiem u dołu kolumny (pozostawić nad powierzchnią słupa adsorbentu kilkumilimetrową jego warstwę).
Każdy z preparatów lecytyny rozpuścić w 2 ml mieszaniny chloroform:metanol (1:1) i wprowadzić roztwór na kolumnę.
Kolumnę rozwijać eluując kolejno:
– 40 ml mieszaniny chloroform:metanol (1:1)
– 20 ml mieszniny chloroform:metanol:woda (2:5:2)
Szybkość elucji nie powinna być większa niż 4 ml/min. Zbierać 8 frakcji po 8 ml, zanalizować je metodą chromatografii cienkowarstwowej porównując z preparatem surowej lecytyny, a następnie zatężyć wyciek zawierający czyste frakcje lecytyny w zważonych kolbkach. Obliczyć wydajność etapu oczyszczania lecytyny uwzględniając przy tym masę surowego preparatu przed oczyszczaniem oraz masę czystej frakcji lecytyny.
Chromatografia cienkowarstwowa
Na 2 płytki (7´4 cm) pokryte żelem krzemionkowym nanieść punktowo roztwory: surowego preparatu lecytyny, supernatantu po odwirowaniu lecytyny oraz frakcji otrzymanych z kolumny (na pierwszą płytkę nanieść surową lecytynę, supernatant i trzy pierwsze frakcje z kolumny, na drugą płytkę nanieść pozostałych pięć frakcji z kolumny). Oba chromatogramy rozwinąć w układzie chloroform:metanol:woda (65:25:4). Po wyschnięciu obejrzeć je pod lampą UV i ołówkiem zaznaczyć widoczne plamki związku, a następnie wywołać przez umieszczenie w komorze z jodem, oraz poprzez spryskanie 10% etanolowym roztworem kwasu siarkowego i ogrzanie na kuchence elektrycznej. Płytki można również wywołać przez spryskanie odczynnikiem Dragendorffa.
