Hydroliza lipidów mleka za pomocą lipazy trzustkowej

PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www

Uniwersytet Gdański (www)
Wydział Chemii (www)
Katedry Chemii Bioorganicznej (www)
Kierownik: Prof. dr hab. Krzysztof Rolka

Adres:
ul. Sobieskiego 18/19
80-952 Gdańsk
Kontakt: tel. 58 52 35 386

____________________________________________________________________________

Lipazy są to enzymy z grupy hydrolaz, które powodują hydrolizę estrów kwasów tłuszczowych. W odróżnieniu od esteraz wykazują aktywność na granicy dwóch faz: wodnej, w której są bardzo dobrze rozpuszczalne i lipidowej. Enzymy te odpowiedzialne są za metabolizm lipidów: fosfolipidów i glikolipidów, będących głównymi składnikami biologicznych membran oraz triacylogliceroli, stanowiących rezerwuar energii. Z uwagi na znaczny udział lipidów w biomasie serca, lipazy odgrywają więc też ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu tego organu. W ostatnich latach wraz z rozwojem biotechnologii wzrasta też zainteresowanie powyższymi enzymami w takich dziedzinach jak: medycyna kliniczna, farmakologia, technologia żywienia, przemysł spożywczy oraz przeróbka olejów.

Aktywność lipazy określa się na podstawie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych, w czasie działania enzymu w optymalnych warunkach w substracie zawierającym tłuszcz. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w próbkach badanego substratu, pobieranych w kolejnych odstępach czasu, oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego wobec fenoloftaleiny jako wskaźnika.

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:

1. Roztwór wieprzowego ekstraktu trzustkowego 1 g/50 mL H2O
2. Kolba stożkowa (250-500 mL)
3. 7 Kolb stożkowych (100 mL)
4. 2 Kolby stożkowe (300-400 mL)
5. Cylinder (100 mL)
6. Pipety (5 mL; 2×10 mL; 25 mL)
7. Lejek zwykły
8. Łaźnia wodna (38°C)
9. Zestaw do miareczkowania
10. 0,05 M roztwór KOH
1. 1% roztwór fenoloftaleiny
2. Metanol
3. Badany produkt (mleko lub śmietanka)
4. Sączki

Wykonanie doświadczenia:

1. Oznaczenie

Do kolby stożkowej o pojemności 250 mL odmierzyć 100 mL mleka lub śmietanki, a następnie kolbę umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 38°C. Przygotować sześć ponumerowanych kolb stożkowych o pojemności 100 mL i do każdej z nich odmierzyć po 25 mL metanolu. Po upływie 10 minut od momentu wstawienia kolby z mlekiem do łaźni, dodać do mleka 30 mL przygotowanego wyciągu enzymatycznego z trzustki i dokładnie wymieszać. Kolbę pozostawić w łaźni wodnej i co kilka minut zamieszać. Po upływie 15 minut od dodania wyciągu enzymatycznego pobrać z mieszaniny reakcyjnej 10 mL roztworu do kolby stożkowej o pojemności 100 mL (próba nr 1). W analogiczny sposób pobrać kolejne próby w ciągu 90 min., w odstępach 15-minutowych (łącznie sześć prób). Poszczególne próbki miareczkować 0,05 M roztworem KOH wobec fenoloftaleiny, do pojawienia się lekko różowego zabarwienia.

2. Próba zerowa

Przenieść 50 cm3 wyciągu enzymatycznego do kolby stożkowej o pojemności 100 mL i ogrzewać do wrzenia w celu inaktywacji enzymu. Po oziębieniu gotowanego roztworu ewentualny wytrącony osad odsączyć. Następnie do kolby stożkowej o pojemności 100 mL (nr 0) odpipetować 10 mL mleka lub śmietanki, 3 mL przesączu z ogrzewanego wyciągu enzymatycznego oraz 25 mL metanolu. Próbę miareczkować analogicznie jak próby badane przy użyciu 0,05 M roztworu KOH wobec fenoloftaleiny. Wyniki zebrać i przedstawić w sprawozdaniu w postaci tabel i wykresów. Uzyskane wyniki z miareczkowania zestawić w tabeli:

Obliczyć mikroekwiwalenty uwolnionych kwasów tłuszczowych z równania:

gdzie:

A – ilość mL 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby właściwej
B – ilość mL 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby zerowej
C – stężenie molowe użytego do miareczkowania KOH
D – ilość mL mleka w próbie poddanej miareczkowaniu = (7,7 mL)

i umieścić w tabeli:

Sporządzić wykres zależności ilości hydrolizowanych kwasów tłuszczowych (mikroekwiwalenty) w czasie (min.)