Hydroliza enzymatyczna peptydu

PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www

Uniwersytet Gdański (www)
Wydział Chemii (www)
Katedry Chemii Bioorganicznej (www)
Kierownik: Prof. dr hab. Krzysztof Rolka

Adres:
ul. Sobieskiego 18/19
80-952 Gdańsk
Kontakt: tel. 58 52 35 386

____________________________________________________________________________

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny do hydrolizy enzymatycznej peptydów:

1. Bufor Tris HCl o pH 8,3
2. Roztwór trypsyny o stężeniu 1mg/mL w 0,1 M roztworze HCl z dodatkiem 20 mM CaCl2
3. Roztwór chymotrypsyny o stężeniu 1mg/mL w 0,1 M roztworze HCl z dodatkiem 20 mM CaCl2
4. 30% kwas octowy
5. 3 mg badanego peptydu
6. Płytki chromatograficzne (20×20 cm) pokryte 0,25 mm warstwą żelu krzemionkowego
7. Komora chromatograficzna do chromatografii cienkowarstwowej (TLC)
8. Kapilary
9. 1% roztwór ninhydryny w etanolu
10. Układ rozwijający BAWP (alkohol n-butylowy : kwas octowy : woda : pirydyna) o następującym składzie 1 : 1 : 1 : 1 (v/v/v/v)
11. Probówki Eppendorfa

Wykonanie doświadczenia:

W dwóch probówkach umieścić 100 µL roztworu peptydu (1mg/mL) i inkubować w temperaturze pokojowej w 2 mL buforu Tris HCl o pH 8,3 z dodatkiem 100 µL roztworu trypsyny (probówka 1) i 100 µL roztworu chymotrypsyny (próbówka 2). Po 2 godzinach inkubacji zakończyć reakcję dodając do probówek 100 µL 30% roztworu kwasu octowego. Następnie wykonać analizę metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) nanosząc na płytkę TLC roztwory z probówki 1 i 2, a także jako odnośniki roztwory trypsyny, chymotrypsyny oraz peptydu. Chromatogram wywołać stosując 1% roztwór ninhydryny w etanolu. Określić podatność analizowanego peptydu na proteolizę. Na podstawie informacji o sekwencji (strukturze I-rzędowej, jeśli peptyd jest liniowy to oba terminy są tożsame, w przeciwnym wypadku do struktury I rzędowej często zaliczana jest lokalizacja układów cyklicznych) peptydu zaproponować miejsca hydrolizy i powstałe fragmenty.

Analiza produktów trawienia białka metodą elektroforezy na żelu agarozowym

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:

1. Bufor TBE (Tris/kwas borowy/EDTA) – roztwór podstawowy 10-krotnie stężony o składzie: 108 g Tris, 55 g kwasu borowego oraz 3,7 g EDTA w 1000 mL wodnego roztworu
2. Bufor ładujący: 50% roztwór gliceryny w buforze TBE z dodatkiem błękitu bromofenylowego
3. Wirówka
4. Żel agarozowy 0,8%
5. Łaźnia wodna
6. Kolby płaskodenne i okrągłodenne
7. Cylindry miarowe
8. Zlewki
9. Agaroza
10. Aparat do elektroforezy agarozowej.
11. Transluminator lub zwykła lampa UV
12. Roztwór Coomasie Blue

Przygotowanie żelu do elektroforezy

Przygotować 2 L rozcieńczonego buforu TBE biorąc 1 część stężonego roztworu i 9 części wody. Następnie naważyć 0,8 g agarozy i umieścić w kolbie płaskodennej zawierającej 100 mL uprzednio przygotowanego buforu. Całość doprowadzić do wrzenia i odczekać (2-3 minuty), aż cały roztwór będzie klarowny. Całość starannie wymieszać. Zmontować pod wyciągiem zestaw do wylewania żelu agarozowego i do poprawnie zamontowanego zestawu (uwaga: sprawdzić szczelność!) wylać roztwór agarozy. Należy pamiętać, aby w zestawie znajdował się grzebień do tworzenia studzienek w żelu. Po 20 minutach przenieść żel do aparatu do elektroforezy agarozowej, zalać żel uprzednio przygotowanym rozcieńczonym buforem TBE i ostrożnie wyjąć grzebień z żelu.

Nanoszenie próbki na żel agarozowy

W 4 probówkach Eppendorfa umieścić kolejno 20, 40, 60 i 100 µL roztworu otrzymanego w wyniku trawienia białka, w kolejnych 2 probówkach Eppendorfa umieścić: 50 µL białka nietrawionego oraz 50 µL enzymu. Do każdej z probówek dodać odpowiednią ilość wody tak aby końcowa objętość roztworu nie przekraczała 100 µL następnie do każdej z nich dodać 25 µL buforu ładującego. Następnie zachowując ostrożność, delikatnie nanieść próbkę do studzienki za pomocą pipety automatycznej. Należy pamiętać o tym, że podczas pracy z białkami trzeba pracować w rękawiczkach jednorazowych, a szkło powinno być czyste (najlepiej przemyte bezpośrednio przed użyciem etanolem i wysuszone).

Elektroforeza w żelu agarozowym

Po naniesieniu próbek podłączyć elektrody do zasilacza i nastawić zasilacz na napięcie 80-100 V. Rozdział prowadzić 120 minut. Po tym czasie od aparatu odłączyć elektrody i ostrożnie wyjąć żel. Zanurzyć żel w roztworze Coomasie Blue. Używając transluminatora zaobserwować rozmieszczenie w żelu pojawiających się plamek pochodzących od produktów hydrolizy białka.