PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Tytuł oryginalny: Wyodrębnianie i identyfikacja fosfolipidów z mózgu
Uniwersytet Gdański (www)
Wydział Chemii (www)
Katedry Chemii Bioorganicznej (www)
Kierownik: Prof. dr hab. Krzysztof Rolka
Adres:
ul. Sobieskiego 18/19
80-952 Gdańsk
Kontakt: tel. 58 52 35 386
____________________________________________________________________________
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny:
1. Tkanka biologiczna – mózg
2. Płytki chromatograficzne (20×20 cm) pokryte 0,25 mm warstwą żelu krzemionkowego z indykatorem UV (Kiselgel 60 F254, Merck)
3. Szkło laboratoryjne: komora chromatograficzna, spryskiwacz, moździerz, probówki, kapilary, pipety, zestaw do sączenia (lejek zwykły + bibuła filtracyjna), cylindry miarowe
4. Suszarka do włosów
5. Spryskiwacz do płytek chromatograficznych
6. Lampa UV (λ=254 nm)
7. Wirówka
8. Roztwór CHCl3 : MeOH (2 : 1; v/v)
9. Roztwór 0,5 M KCl w 50% MeOH
10. Układ rozwijający: CHCl3 : EtOH : trietyloamina : H2O (4 : 5 : 4 : 1; v/v/v/v)
11. Układ wywołujący: 0,01% roztwór rodaminy 6G w 95% etanolu
12. Standardy lipidów: fosfatydyloseryny, fosfatydylocholiny, lizofosfatydylocholiny, fosfatydyloetanoloaminy, N-metylofosfatydyloetanoloaminy, N,N-dimetylofosfatydyloetanoloaminy, lizofosfatydyloetanoloaminy (1 mg/ mL w CHCl3 : MeOH (2 : 1; v/v).
Wykonanie doświadczenia:
200 mg mózgu rozdrobnić w moździerzu. Dodać 10 mL roztworu CHCl3 : MeOH (2 : 1; v/v) i dokładnie wytrzasnąć na worteksie. Następnie całość poddać homogenizacji w probówce umieszczonej w łaźni lodowej, po czym sonikować na łaźni ultradźwiękowej. Otrzymaną zawiesinę odwirować przez 5 min przy 1500 RPM. Zebrać pipetą Pasteura supernatant. Do pozostałego osadu dodać ponownie 10 mL roztworu CHCl3 : MeOH (2 : 1; v/v), wytrząsnąć na worteksie, odwirować jak poprzednio i zebrać supernatant. Do połączonych warstw organicznych (supernatant 1 i 2) dodać 5 mL 0,5 M KCl w 50% MeOH, wytrząsnąć na worteksie i odwirować jak poprzednio. Za pomocą pipety Pasteura usunąć ostrożnie górną warstwę, a do warstwy dolnej dodać ponownie 5 mL 0,5 M KCl w 50% MeOH, następnie wytrząsnąć na worteksie i odwirować. Ponownie usunąć górną warstw“, a do pozostałej warstwy organicznej dodać bezwodnego Na2SO4. Po 10 min roztwór przesączyć do suchego i zważonego naczynka wagowego. Rozpuszczalnik organiczny usunąć za pomocą strumienia azotu. Pozostałą mieszaniną lipidów zważyć i ponownie rozpuścić w 0,5 ml roztworu CHCl3 : MeOH (2 : 1; v/v).
Na płytce chromatograficznej* (20×20 cm) w odległości 2 cm od brzegu narysować delikatnie miękkim ołówkiem linię, na której co 1,5 cm należy zaznaczyć punkty. W oznaczonych punktach nanieść kapilarą poszczególne roztwory standardów lipidów oraz ekstrakt lipidów. Odparować rozpuszczalnik chłodnym strumieniem powietrza z suszarki do włosów. Włożyć płytkę do komory chromatograficznej nasyconej parami układu rozwijającego i pozostawić do momentu, gdy czoło układu rozwijającego osiągnie poziom około 2 cm od górnego brzegu płytki. Po wyjęciu płytki z komory chromatograficznej położyć ją na czystej bibule na blacie pod włączonym wyciągiem, narysować miękkim ołówkiem linię czoła rozpuszczalnika, po czym wysuszyć za pomocą suszarki do włosów i spryskać (pod włączonym wyciągiem!) układem wywołującym.
Odparować etanol (chłodny strumień suszarki do włosów), umieścić płytkę w świetle lampy UV (λ254) i delikatnie miękkim ołówkiem obrysować pojawiające się plamy. Wyznaczyć wartości Rf dla standardów lipidów i badanej próbki. Na podstawie obliczonych wartości Rf zidentyfikować lipidy obecne w badanej tkance.
*podczas wszystkich operacji należy unikać dotykania złoża płytki palcami.
