Porównanie wyciszenia ekspresji genu

PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Fragment skryptu: Biologia molekularna roślin

Uniwersytet Warszawski (www)
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN (www)
Zakład Biologii Molekularnej Roślin (www)
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

Adres:
ul. Pawińskiego 5a,
02-106 Warszawa

Kontakt: tel. (+48 22) 592 5704,
E-mail: andyj@ibb.waw.pl

Zakład Biologii Molekularnej Roślin

Problematyka badawcza: Rola struktury chromatyny w regulacji rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na czynniki stresowe i hormonalne. Prowadzone aktualnie badania mają na celu poznanie funkcji roślinnych kompleksów remodelujących chromatynę, histonu H1 i modyfikacji potranslacyjnych histonów rdzeniowych, a także opisanie proteomu jądrowego rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.
Stosowane techniki: Większość metod biologii molekularnej, metody biochemii białek, analiza proteomiczna (mass-spec) i transkryptomiczna (mikromacierze), genetyka Arabidopsis thaliana (konstrukcja i analiza mutantów), metody bioinformatyczne.
_______________________________________________________________________________

Tytuł oryginalny:

Porównanie wyciszenia ekspresji genu H 1.3 w mutancie insercyjnym i mutancie amiRNA

Struktura chromatyny ma duże znaczenie w regulacji procesów związanych z DNA, takich jak replikacja, rekombinacja, naprawa oraz transkrypcja. Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom, zbudowany z oktameru histonów rdzeniowych H2A, H2B, H3 i H4. Funkcja histonów rdzeniowych jest obecnie dobrze poznana, natomiast niewiele wiadomo o roli histonu łącznikowego H1. Białko to przyłączone jest do nukleosomu od zewnątrz. Mimo, że histon H1 występuje w jądrach komórkowych w dużej ilości i jest silnie konserwowany ewolucyjnie, wiele prostych organizmów jest w stanie prawidłowo funkcjonować pomimo uszkodzenia genów kodujących H1. U organizmów wyższych H1 występuje w wielu wariantach i jest niezbędny do ich prawidłowego funkcjonowania. Arabidopsis thaliana posiada trzy izoformy histonu H1 (H1.1, H1.2 i H1.3).

W dostępnych kolekcjach mutantów insercyjnych możemy znaleźć linię h1.3_1 pozbawioną funkcjonalnego genu H1.3. W celu uzyskania roślin z wyłączoną ekspresją genów kodujących histony możemy również zastosować technikę RNAi.

Celem doświadczenia jest porównanie stopnia obniżenia ekspresji genu H1.3 w mutancie insercyjnym i mutancie uzyskanym przy użyciu metody sztucznych mikroRNA (amiRNA).

Izolacja DNA

Pierwszym etapem izolacji genomowego DNA z komórki roślinnej jest pozbycie się ściany komórkowej. Utarcie w moździerzu zamrożonego w ciekłym azocie materiału roślinnego pozwala na mechaniczne uszkodzenie ścian komórkowych. Następny etap to rozpuszczenie błon komórkowych. Detergenty takie jak SDS (dodecylosiarczan sodu) lub CTAB (bromek heksadecylotrimetylo amoniowy) zawarte w buforach do ekstrakcji DNA umożliwiają rozpuszczenie błon. EDTA chelatujący jony magnezu, naturalne kofaktory większości nukleaz, chroni uwolniony DNA przed działaniem endogennych enzymów o aktywności nukleolitycznej. Zwykle otrzymany preparat DNA zawiera duże ilości RNA. Aby pozbyć się zanieczyszczającego RNA, preparat poddajemy trawieniu RNazą A wolną od DNaz.

Jeśli uzyskany preparat zanieczyszczony jest białkami, można potraktować go proteinazą K i przeprowadzić oczyszczanie DNA za pomocą fenolu. Otrzymany wysokocząsteczkowy DNA genomowy należy chronić przed zbyt częstym zamrażaniem i rozmrażaniem, ponieważ DNA ulega fragmentacji i preparat traci na jakości. W trakcie preparatyki najlepiej stosować odczynniki i materiały świeżo przygotowane, tak aby podczas preparatyki nie wprowadzić obcego DNA, który może przeszkadzać w dalszej analizie otrzymanego DNA (np. analiza metodą PCR może dać błędne wyniki).

Podczas izolacji DNA można wykorzystać złoża Chelex 100. Mechanizm działania Chelex-u nie jest dokładnie poznany, wiadomo jednak, że jest on silnym chelatorem jonów metali, przez co zabezpiecza DNA przed rozpadem w wysokiej temperaturze (100ºC) i degradacją przez nukleazy. Izolacja DNA z wykorzystaniem chelexu jest powszechnie stosowana w badaniach kryminalistycznych śladów DNA.

Amplifikacja fragmentu DNA metodą PCR

Technika PCR, opracowana w latach 80-tych, zrewolucjonizowała genetykę molekularną, umożliwiając otrzymywanie dużej liczby kopii unikalnych fragmentów DNA bez konieczności stosowania żmudnych i długotrwałych procedur klonowania. Metoda PCR oparta jest na replikacji DNA in vitro. Polimeraza DNA, wykorzystując jednoniciowe DNA (ang. single-stranded DNA, ssDNA) jako matrycę do syntezy nici komplementarnej, wymaga również krótkich fragmentów dwuniciowych, aby zapoczątkować syntezę nowej nici w kierunku 5’ – 3’. W praktyce laboratoryjnej jednoniciowe DNA uzyskuje się ogrzewając DNA dwuniciowe (ang. double-stranded DNA, dsDNA) do temperatury bliskiej 100°C, zaś jako startery służą dodawane oligonukleotydy (tzw. primery) wiążące się specyficznie (hybrydyzujące) z określonym miejscem na jednoniciowej matrycy. Oligonukleotydy hybrydyzują z miejscami na obydwu niciach. Dobiera się je tak, aby oskrzydlały odcinek DNA, który ma być zreplikowany. Replikacja rozpoczyna się od primerów na każdej nici i zachodzi na obu niciach w przeciwstawnych kierunkach. Na nowo syntetyzowanych niciach powstają zatem nowe miejsca wiązania primerów.

Po zakończeniu replikacji nici są rozdzielane (denaturacja), aby ponownie umożliwić wiązanie znajdujących się w nadmiarze primerów (tzw. annealing), syntezę DNA i kolejne rozdzielenie nici. Cykl taki powtarza się wielokrotnie, a po n cyklach otrzymuje się teoretycznie 2 do potęgi n-tej dwuniciowych cząsteczek DNA będących kopiami sekwencji zawartej pomiędzy primerami.

Typowy schemat reakcji PCR jest więc szeregiem cykli złożonych z następujących etapów:

1. denaturacja DNA (30 s – 1 min. 90 – 95°C),

2. hybrydyzacja primerów (annealing) (20 s – 2 min. 40 – 60°C),

3. wydłużanie (synteza DNA) (1 – 3 min. 68 – 75°C).

W każdym cyklu liczba cząsteczek syntetyzowanego DNA jest podwajana. Efektem replikacji DNA techniką PCR jest więc amplifikacja specyficznego obszaru DNA.

Amplifikacja DNA metodą PCR znajduje szereg zastosowań w diagnostyce i terapii, m.in. do mapowania mutacji, monitorowania leczenia nowotworów, wykrywania infekcji bakteryjnych i wirusowych czy ustalania płci w badaniach prenatalnych. PCR daje się stosunkowo łatwo zastosować jako technika laboratoryjna. Materiałem wyjściowym do amplifikacji jest DNA zawierający interesującą nas sekwencję. Ilość DNA stosowanego do PCR jest bardzo mała (teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka DNA). Do mieszaniny reakcyjnej, oprócz DNA, dodaje się nadmiar primerów (dwa rodzaje primerów określających miejsce startu replikacji na każdej nici), polimerazę DNA, odpowiedni bufor zawierający jony magnezu oraz mieszaninę 4 prekursorów DNA, tj. trifosforanów 2-deoksyrybonukleotydów (dNTP).

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru następujących parametrów:

1. starterów reakcji amplifikacji (program Primer3). Projektując startery reakcji PCR, należy je dobrać tak, aby:

– starter zawierał od 40 do 60% par GC,
– starter był wysoko specyficzny dla danej sekwencji,
– startery nie tworzyły struktur typu szpilka do włosów lub konkatamerów,
– długość primerów wynosiła około 20 – 30 par zasad, a temperatura ich topnienia 50 – 60°C,
– startery nie powinny zawierać w 3’ końcowej części fragmentów komplementarnych do siebie samych oraz do drugiego startera,

2. parametrów reakcji amplifikacji (stężenia dNTP, polimerazy, starterów, jonów magnezu). Do reakcji PCR używa się polimerazy z bakterii Thermus aquaticus (Taq polimeraza) lub innych termostabilnych polimeraz DNA (np. Pfu, Pwo, Vent). Mają one tę przewagę nad innymi polimerazami DNA, że są stabilne nawet w 94°C (optimum temperaturowe wynosi 72°C), a więc mogą być dodane jednorazowo na samym początku reakcji PCR, nie ulegając dezaktywacji w trakcie kolejnych cykli podgrzewania,

3. warunków reakcji PCR (temperatury, czasów trwania, ilości cykli itp.). Czasy i temperatury dobiera się według zaleceń producenta polimerazy. Temperatura przyłączania starterów zależy od ich długości i temperatury topnienia. Reakcję prowadzi się w objętości 10 – 50 μl. Probówki z mieszaniną reakcyjną umieszcza się w termocyklerze (ang. thermal cycler), w którym programuje się czas trwania i liczbę cykli oraz temperaturę poszczególnych etapów reakcji. Zwykle stosuje się 25 do 35 cykli.

Genotypowanie roślin

Arabidopsis thaliana jest organizmem diploidalnym, co oznacza, że w jednej roślinie każdy gen występuje w postaci dwóch alleli, które mogą być identyczne (roślina jest homozygotą) lub różne (heterozygota). Jeśli analizowana jest mutacja recesywna, to w celu odróżnienia roślin typu dzikiego od heterozygot zawierających zmutowany allel konieczne jest genotypowanie. Genotypowanie jest również niezbędne, gdy mutanty homozygotyczne nie posiadają wyraźnych cech fenotypowych, a także w analizie potomstwa pochodzącego z krzyżówki dwóch różnych mutantów, w której poszukiwane są podwójne heterozygoty.

Metodą pewną i względnie prostą, która pozwala na zgenotypowanie roślin jest PCR. Genotypowanie linii zawierających mutację w postaci delecji lub insercji najczęściej polega na bezpośredniej analizie wielkości amplifikowanych fragmentów DNA. W tej metodzie kluczowy jest dobór odpowiednich primerów, tak aby możliwe było odróżnienie produktów odpowiadających dzikiemu i zmutowanemu allelowi.

¬W przypadku analizy mutantów insercyjnych pochodzących z kolekcji mutantów primery dobiera się według określonego schematu. Wykorzystuje się tu fakt, że sekwencja oraz pozycja (przynajmniej przybliżona) insercji T-DNA jest znana. Primery 1 i 2 są komplementarne do sekwencji genu flankujących insercję od strony 5’ i 3’ i służą do amplifikacji fragmentu DNA odpowiadającego dzikiemu allelowi genu. Primer 3 jest komplementarny do sekwencji insercji T-DNA sąsiadującej z DNA genomowym i wraz z primerem 1 lub 2 (w zależności od orientacji T-DNA, na Rys. 1 jest to primer 2) daje produkt PCR odpowiadający allelowi zmutowanemu.


Rys. 1. Schemat położenia primerów do genotypowania roślin z insercją T-DNA.

Amplifikacja odpowiednich fragmentów DNA może być przeprowadzona w dwóch oddzielnych reakcjach PCR, bądź też w jednej reakcji z użyciem trzech primerów jednocześnie (Rys. 2). Primery do genotypowania można zaprojektować samodzielnie lub korzystając z programów dostępnych na stronach internetowych poświęconych kolekcjom mutantów inercyjnych.

Rys. 2. Spodziewane wyniki genotypowania z użyciem trzech primerów

Sztuczne mikroRNA

MikroRNA to 21-24 nukleotydowe cząsteczki jednoniciowego RNA. Sekwencja miRNA jest kodowana w genomie i transkrybowana przez polimerazę RNA II (PolII). MikroRNA powstaje z transkryptów RNA tworzących specyficzne struktury drugorzędowe, w których występują rejony do siebie komplementarne (pre-miRNA). Transkrypt pre-miRNA w jądrze komórkowym jest przetwarzany przy udziale białka DCL1 (ang. Dicer-Like 1) oraz białka HYL1, które wiąże dwuniciowe RNA. W rezultacie powstają dupleksy miRNA, których końce 3’ są metylowane przez białko HEN1. Produkty są transportowane do cytoplazmy i tam jedna nić dupleksu włączana jest do kompleksu RISC (ang. RNA Induced Silencing Complex), wiążąc się do białka z rodziny Argonaute (AGO1). Po przyłączeniu się do docelowego mRNA wg zasady komplementarności, transkrypt jest degradowany, więc nie może zostać wykorzystany w tworzeniu białka. Niektóre mikroRNA hamują również translację białka (Rys. 3).

Rys. 3. Schemat powstawania i działania miRNA w A. thaliana.

Sztuczne mikroRNA (ang. artificial micro RNA – amiRNA) to jednoniciowe 21-nukleotydowe RNA powstające z prekursora wprowadzonego do rośliny poprzez transformację. Mechanizm jego działania jest analogiczny do funkcjonowania miRNA. Jednak amiRNA normalnie nie występuje w roślinach, tylko jest projektowany tak, aby przypominał naturalne miRNA i specyficznie wyciszał ekspresję interesującego nas genu. Do zaprojektowania odpowiedniej sekwencji amiRNA przydatnym narzędziem jest program WMD 2 (ang. Web MicroRNA Designer) dostępny w Internecie. Program ten na podstawie wprowadzonej sekwencji genu wybiera najbardziej odpowiednie 21-nukleotydowe sekwencje sztucznego miRNA. Obecność transgenu kodującego sztuczne miRNA do sekwencji genu H1.3 można potwierdzić stosując startery do genu oporności na herbicyd Basta (Nos-BAR), użytego do selekcji transformantów. Gen ten jest wprowadzany na tym samym T-DNA (Rys. 4).

Rys. 4. Schemat T-DNA (w plazmidzie binarnym pCambia0390) użytego do utworzenia sztucznego mikroRNA wyciszającego ekspresję genu H1.3. RB/LB- lewa i prawa granica insertu, 35Senh/CaMV35S- silny promotor z wirusa mozaiki kalafiora, amiRNA wyciszający ekspresję H1.3. Nos polyA – terminator transkrypcji.

Zobacz: Izolacja RNA

RT-PCR

RT-PCR jest techniką łączącą reakcję odwrotnej transkrypcji oraz reakcję PCR. Sprowadza się ona do amplifikacji specyficznego fragmentu RNA, dzięki czemu możliwa jest detekcja oraz oszacowanie poziomu ekspresji genów. Pod tym względem RT-PCR uzupełnia się, lub stosuje się zamiennie z takimi technikami biologii molekularnej jak Northern blot, hybrydyzacja In situ oraz mikromacierze DNA. Wśród zastosowań metody RT-PCR można wymienić m.in. badanie alternatywnych form splicingowych, wykrywanie markerów nowotworowych, detekcję transkrypcji genów wprowadzanych do organizmów transgenicznych oraz określanie wpływu mutacji na poziom ekspresji genów. Pierwszym etapem RT-PCR jest reakcja odwrotnej transkrypcji, tj. synteza nici komplementarnego DNA (cDNA) na matrycy RNA, prowadzona przez enzym odwrotną transkryptazę. Właściwa reakcja PCR następuje dopiero po reakcji odwrotnej transkrypcji. Jest to konieczne z uwagi na to, że RNA nie jest matrycą dla termo stabilnych polimeraz DNA używanych w reakcji PCR.