Ogniskowanie izoelektryczne

PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Fragment skryptu: Biologia molekularna roślin

Uniwersytet Warszawski (www)
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN (www)
Zakład Biologii Molekularnej Roślin (www)
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

Adres:
ul. Pawińskiego 5a,
02-106 Warszawa

Kontakt: tel. (+48 22) 592 5704,
E-mail: andyj@ibb.waw.pl

Zakład Biologii Molekularnej Roślin

Problematyka badawcza: Rola struktury chromatyny w regulacji rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na czynniki stresowe i hormonalne. Prowadzone aktualnie badania mają na celu poznanie funkcji roślinnych kompleksów remodelujących chromatynę, histonu H1 i modyfikacji potranslacyjnych histonów rdzeniowych, a także opisanie proteomu jądrowego rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.
Stosowane techniki: Większość metod biologii molekularnej, metody biochemii białek, analiza proteomiczna (mass-spec) i transkryptomiczna (mikromacierze), genetyka Arabidopsis thaliana (konstrukcja i analiza mutantów), metody bioinformatyczne.
_______________________________________________________________________________

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym stwarza możliwość frakcjonowania białek zależnie od ich punktów izoelektrycznych (pI) – metoda ta to ogniskowanie izoelektryczne (IEF). Wykorzystuje ona rozdział w żelu poliakrylamidowym, w którym utworzono gradient pH między katoda a anodą, wywołany elektrolizą amfoterycznych, syntetycznych związków buforowych – amfolitów.

Zasada działania ogniskowania izoelektrycznego

Jeśli wprowadzi się do żelu poliakrylamidowego z amfolitami substancje o charakterze amfoterycznym, np. polipeptydy, to podczas elektroforezy wędrują one do miejsc w żelu o wartości pH odpowiadającej pI, czyli stref, w których ładunek sumaryczny cząsteczek wynosi zero. Dobrą jakość amfolitów warunkuje niewielka masa cząsteczkowa (300-500), znaczna pojemność buforowa, dobra rozpuszczalność w wodzie oraz mała absorbcja w paśmie UV, zwłaszcza w zakresie 260-280 nm. Takie własności mają syntetyczne izomery i homologi kwasów poliaminopolikarboksylowych.

Warunki elektroforeza za pomocą ogniskowania izoelektrycznego

Elektroforeza białek za pomocą ogniskowania izoelektrycznego przebiega zwykle w obecności dużych stężeń mocznika i detergentów niejonowych, które umożliwiają analizę białek trudno rozpuszczalnych (elektroforeza w warunkach denaturujących). Obecnie ogniskowanie izoelektryczne przeprowadza się w komercyjnie dostępnych immobilizowanych gradientach pH. Paski żelu z gradientem pH są dostarczane w formie zliofilizowanej (suche). Najczęściej paski te rehydratuje się buforem zawierającym rozdzielane białka, amfolity, mocznik i detergenty.

Przy elektroforezie w immobilozowanych gradientach pH stosuje się bufory o jak najmniejszym stężeniu soli, co pozwala na zastosowanie wysokiego napięcia przy rozdziale białek. Ogniskowanie izoelektryczne z zastosowaniem gotowych gradientów pH prowadzi się zwykle przez 10 – 36 godzin przy stałym napięciu 3000 – 8000V. Natężenie prądu przy takiej elektroforezie jest bardzo niskie i zwykle nie przekracza 100 μA na jeden pasek z gradientem.