PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Tytuł oryginalny: Wyodrębnianie RNA z drożdży. Elektroforeza agarozowa kwasów nukleinowych
<img src=”http://e-biotechnologia.pl/obrazki/chemia.jpg” ALIGN=”left” alt=”Wydział Chemii UG” HSPACE=33 VSPACE=22/> Uniwersytet Gdański (www)
Wydział Chemii (www)
Katedry Chemii Bioorganicznej (www)
Kierownik: Prof. dr hab. Krzysztof Rolka
Adres:
ul. Sobieskiego 18/19
80-952 Gdańsk
Kontakt: tel. 58 52 35 386
____________________________________________________________________________
RNA (kwas rybonukleinowy) obecny w drożdżach można wyekstrahować ze zhomogenizowanych komórek za pomocą 2% roztworu soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS). Tak otrzymany ekstrakt zawiera niewielkie ilości DNA (<0,5%) i białek (<2,0%).
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny.
1. Świeże drożdże
2. 2% roztwór SDS (soli sodowej siarczanu dodecylu)
3. 95% etanol
4. Roztwór octanu potasu (200 g/L, pH 5,0)
5. Bufor TBE (Tris/kwas borowy/EDTA) – roztwór podstawowy 10-krotnie stężony o składzie: 108 g Tris, 55 g kwasu borowego oraz 3,7 g EDTA w 1000 mL wodnego roztworu.
6. Bufor ładujący: 50% roztwór gliceryny w buforze TBE z dodatkiem błękitu bromofenylowego
7. Wirówka
8. Łaźnia wodna
9. Kolby płaskodenne i okrągłodenne
10. Cylindry miarowe
11. Zlewki
12. Agaroza
13. Bromek etydyny
14. Aparat do elektroforezy agarozowej.
15. Transluminator lub zwykła lampa UV
Wykonanie doświadczenia:
Izolacja RNA
W kolbie płaskodennej doprowadzić do wrzenia 10 mL 2% roztworu SDS. Do wrzącego roztworu dodać 2 g rozdrobnionych świeżych drożdży i zawartość ogrzewać przez 3 minuty. Następnie kolbę schłodzić strumieniem zimnej wody z kranu, przenieść zawartość kolby do probówki wirówkowej i odwirować przez 10 min przy 6000 RPM. Supernatant przenieść do kolbki płaskodennej, dodać 1 mL roztworu octanu potasu, a następnie 22 mL etanolu. Mieszaninę z wytrąconym RNA pozostawić na łaźni lodowej przez 0,5 godziny, a następnie odwirować przez 6 min przy 6000 RPM. Roztwór znad osadu zdekantować, zaś otrzymany osad RNA rozpuścić w 1 mL wody. Roztwory otrzymane w wyniku izolacji RNA z drożdży należy przechowywać w temperaturze 0°C, aż do momentu ich analizy.
Przygotowanie żelu do elektroforezy
Przygotować 2 L rozcieńczonego buforu TBE biorąc 1 część stężonego roztworu i 9 części wody. Następnie naważyć 0,8 g agarozy i dodać ją do 100 mL uprzednio przygotowanego buforu w kolbie płaskodennej. Całość doprowadzić do wrzenia i odczekać, aż cały roztwór będzie klarowny. Odczekać 2-3 minuty a następnie dodać 5 µL bromku etydyny (* bromek etydyny jest substancją kancerogenną i należy pracować tylko w rękawiczkach!).
Po rozpuszczeniu bromku etydyny całość starannie wymieszać. Zmontować pod wyciągiem zestaw do wylewania żelu agarozowego i do poprawnie zamontowanego zestawu (uwaga: sprawdzić szczelność!) wylać roztwór agarozy. Należy pamiętać, aby w zestawie znajdował się grzebień do tworzenia studzienek w żelu. Po 20 minutach przenieść żel do aparatu do elektroforezy agarozowej, zalać żel uprzednio przygotowanym rozcieńczonym buforem TBE i ostrożnie wyjąć grzebień z żelu.
Nanoszenie próbki na żel
W probówkach Eppenorfa umieścić kolejno 20, 40, 60 i 100 µL otrzymanego w wyniku izolacji roztworu RNA i do każdej z nich dodać odpowiednio takie same objętości buforu ładującego. Następnie zachowując ostrożność delikatnie nanieść próbkę do studzienki za pomocą pipety automatycznej. Należy pamiętać o tym, że podczas pracy z RNA lub DNA, trzeba pracować w rękawiczkach jednorazowych, a szkło powinno być czyste (najlepiej przemyte bezpośrednio przed użyciem etanolem i wysuszone).
Elektroforeza na żelu agarozowym
Po naniesieniu próbek podłączyć elektrody do zasilacza i nastawić zasilacz na napięcie 80-100 V. Rozdział prowadzić godzinę. Po tym czasie od aparatu odłączyć elektrody i ostrożnie wyjąć żel. Używając transluminatora lub zwykłej lampy UV można zaobserwować migrację RNA w żelu agarozowym.
